細(xì)胞凍存是又是最復(fù)雜的生物學(xué)實驗，簡單是因為初入門的生物學(xué)小白也懂得如何凍存細(xì)胞；而復(fù)雜是因為，一個細(xì)胞凍存方案，是個國際性難題——如何優(yōu)化冷凍保護(hù)劑(Cryoprotectant CPA),如何科學(xué)優(yōu)化凍存曲線，保證一個好的復(fù)蘇活率，這是個仰之彌高，鉆之彌堅的問題。

低溫生物學(xué)領(lǐng)域最著名的，莫過于Mazur雙因素假說——水冰相變

根據(jù)Mazur兩因素假說，細(xì)胞在凍存過程中，如果降溫太慢，就會發(fā)生不可逆的損傷性脫水，例如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在結(jié)構(gòu)上受損。如果冷卻太快，細(xì)胞沒有足夠的時間來達(dá)到最佳脫水狀態(tài)，剩余的細(xì)胞內(nèi)水會形成冰，這也是有害的，會損害細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)。

Applications and optimization of cryopreservation technologies to cellular therapeutics

Mazur雙因素假說符合多年來實際觀察到的結(jié)果。這就是經(jīng)常被引用的“-1℃/min冷卻速率”的起源 “-1℃”并不是一個神秘的數(shù)字，而是反映了在低溫保存過程中，細(xì)胞達(dá)到最佳脫水狀態(tài)所需的時間。這是在冷卻細(xì)胞時生物質(zhì)本身的安全冷卻動力學(xué)，而不僅僅是冷凍設(shè)備的控制參數(shù)。

沖擊冷卻，誘導(dǎo)冰核產(chǎn)生

當(dāng)液體冷卻時，只有當(dāng)溫度降至溶液的平衡冰點(diǎn)以下時才能發(fā)生成核，在冰成核過程中，液體分子相互碰撞、聚集并形成團(tuán)簇。這是一個隨機(jī)發(fā)生的過程。通過在低溫冷卻器中快速冷卻約2分鐘，引入簡短的“沖擊冷卻”步驟，也可以誘導(dǎo)冰核產(chǎn)生。冰成核是相變的一部分，冰晶的形成是一種放熱相變，向環(huán)境釋放熱量，使樣品瞬間升溫。此時需要引入一個保持時間（大約10分鐘，取決于樣本），以允許冷卻控制的潛熱消散。

Walking on thin ice: controlled freezing & thawing of pharmaceutical active molecules

凍存保護(hù)劑的影響

Kymriah和Yescarta (FDA批準(zhǔn)的前兩種CART細(xì)胞藥物)分別使用7.5%和5%的DMSO進(jìn)行低溫保存，在冷凍保存溶液中添加類似的糖和/或大分子。二甲基亞砜(DMSO)，被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”冷凍保護(hù)劑(CPA)，用于冷凍保存幾乎所有有治療意義的細(xì)胞(紅細(xì)胞除外)。DMSO在長期暴露和輸注期間具有高度的細(xì)胞毒性，可在高達(dá)50%的患者中引起輕微不良反應(yīng)，以及更罕見但更嚴(yán)重的心血管、神經(jīng)或呼吸問題。

一些CPA(如二甲基亞砜或甘油)會穿過細(xì)胞膜并提供細(xì)胞內(nèi)保護(hù)，而其他一些制劑，如糖或聚合物，雖然細(xì)胞內(nèi)滲透很少，依然可以在細(xì)胞系統(tǒng)中提供CPA效應(yīng)，這歸因于它們產(chǎn)生部分脫水和限制細(xì)胞內(nèi)有害冰晶的形成。

這是一個“經(jīng)驗法則”，幾乎所有有核的哺乳動物細(xì)胞在冷凍保存期間都需要細(xì)胞內(nèi)保護(hù);非滲透性CPA可以為調(diào)節(jié)細(xì)胞外環(huán)境中的冰晶生長(從而有助于減輕冰形成的滲透效應(yīng))。大分子聚合物，不進(jìn)入細(xì)胞，直接保護(hù)細(xì)胞膜，誘導(dǎo)在細(xì)胞外形成玻璃化的溶液。

Applications and optimization of cryopreservation technologies to cellular therapeutics

不同的包材類型對程序性降溫過程的顯著影響

Development of a Reliable, Low-cost, Controlled Cooling Rate Instrument for the Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells

一套穩(wěn)定成熟的程序降溫方式，可以有效維持細(xì)胞活性，滿足細(xì)胞高質(zhì)量凍存需求，保證細(xì)胞凍存環(huán)節(jié)的安全性，合規(guī)性。一臺安全可靠的程序性降溫儀，是至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)。它可以提供沖擊冷卻，控制冰核生成，保證一度每分鐘的降溫速率，均一化標(biāo)準(zhǔn)化地冷凍大批量的樣本。

程序性降溫主要是通過微處理器控制系統(tǒng)和電磁閥，通過控制噴入腔體中的液氮量來精確控制降溫速率。其優(yōu)點(diǎn)是：控溫精確，受外界環(huán)境影響小。尤其是處理大體積樣本時，快速噴入的大量液氮更易帶走樣本中的潛熱，從而快速降溫，保證更好的樣本復(fù)蘇活性。

BioLife Solutions 全系列程序降溫儀，將您的選擇。

可提供完善的六套預(yù)設(shè)程序，同時提供無限的程序編輯能力，更精確的溫度控制系統(tǒng)，符合21CRF Part11的合規(guī)要求、不同容量型號滿足細(xì)胞研究各階段冷凍能力需求，降低凍存成本，確保流程一致性。

Biolife Solutions程序控制降溫儀提供配套電腦及軟件，操作簡單，實時溫控曲線呈現(xiàn)，模板方案調(diào)用查詢方便，合規(guī)數(shù)據(jù)報告導(dǎo)出等，為優(yōu)化程序性降溫流程提供解決方案。

程序降溫儀可以提供精確的溫度控制，確保樣本在冷凍過程中溫度的均一性及良好的批間一致性。這對于細(xì)胞、組織和其他生物樣本的長期儲存和活率保持非常重要。而現(xiàn)在我們提供了整體凍存的解決方案從28L-67L-781L，獲得準(zhǔn)確的溫度控制，達(dá)到小規(guī)模試驗到GMP生產(chǎn)級別的工藝連貫性。